Cell Viability Assay - MTT Assay

{English below}

 Thử nghiệm MTT là gì?

Thử nghiệm MTT là một thử nghiệm so màu đánh giá sự hoạt động của tế bào, [1] xác định số lượng tế bào sống hiện diện.

Nguyên tắc phản ứng là gì?

Enzyme oxidoreductase tế bào NAD(P)H phụ thuộc tồn tại phần lớn trong cytosolic của tế bào sống. Những enzyme oxidoreductase tế bào NAD(P)H-phụ thuộc thể hiện số lượng tế bào sống hiện diện, những enzyme này có thể làm giảm màu thuốc nhuộm MTT thành dạng formanzan không hòa tan.

Hình phản ứng của thuốc nhuộm MTT tạo thành tủa formazan

 Có những loại thuốc nhuộm nào? 

Các thuốc nhuộm thông thường: XTT, MTS, WST. Thuốc thử MTT rất nhạy cảm với ánh sáng. WST-1 không thấm được màng tế bào, sự khử xảy ra bên ngoài tế bào thông qua sự vận chuyển điện tử màng plasma [2].

• MTT – một tetrazole màu vàng, bị khử thành formazan màu tím (dạng tủa) trong tế bào sống [3]. Sau đó, sử dụng DMSO (hoặc một số chất khác) để hòa tan thành dung dịch màu trước khi đo mức độ hấp thụ màu. Độ hấp thụ dung dịch này có để định lượng bằng cách đo ở một bước song nhất định bằng máy quang phổ (thường 500-600nm). Độ hấp thụ phụ thuộc vào dung môi hòa tan.
• XTT – (2,3-bis-(2-methoxyl-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilile) có thể thay thế MTT, loại thuốc thử này có tính nhạy cảm cao hơn MTT và sử dụng đơn giản hơn. Sản phẩm của phản ứng này có thể hòa tan trong nước trước khi đo độ hấp thụ. 
• MST (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), trong sự có mặt của phenazine methosulfate (PMS) bị khử tạo thành sản phẩm tan trong dung môi muối đệm phosphate, và hấp thu ở bước sóng tối đa 490 nm.
• WST (muối tetrazolium tan trong nước) là một loạt các thuốc nhuộm hòa tan trong nước. Sản phẩm formazan của thuốc nhuộm này có thể đọc trực tiếp không cần thông qua bước hòa tan trước khi đọc. WST cho tín hiệu hiệu quả hơn MTT. Ngoài ra, WST còn giảm độc tính cho tế bào (không giống như MTT thấm vào tế bào và formazan tích lũy bên trong các tế bào) [4]. 

Thuốc nhuộm WST từ màu hồng chuyển màu cam (hình thực nghiệm) 

-English-

What is MTT assay? 

MTT assay is coloricmetric assay for vadiating cell metabolic activity [1], make out the number of viable cells present. 

MTT assay or viability assay or CCK-8 assay are different names as the same function and the same protocol.

 What is the principle of MTT assay? 

NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzymes is largely assumed in the cytosolic compartment of the cell. These enzymes are able to reduce the tetrazolium dye MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide to insoluble formazan.

MTT reaction produces formazan product

How many kinds of dyes?  

The tetrazolium dye includes XTT, MTS, WST. They are very sensitive with light. Specially, WST-1 is cell-impermeable, the reduction occurs outside the cell via plasma membrane electron transport [2].

• MTT- yellow tetrazole, is reduced to purple formazan in living cells [3]. Then, using DMSO to soluble formazan product into a colored solution. Measuring this colored solution at a certain wavelength by spectrophotometer. The degree of light absorption depends on the solvent.
• XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitrp-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) is able to replace MTT, highly sensitivity and dynamic range. The formed formazan dye is water-soluble, avoiding a final solubilization step.
• MST (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), in present of phenazine methosulfate (PMS), produces a formazan product has an absorbance maximum at 490 nm in phosphate-buffered saline.
• WST (water-soluble tetrazolium salts) is water-soluble dye for MTT assays. WST assay can be read directly (unlike MTT that need a solubilization step), give a more effective signal than MTT, decrease toxicity to cells (unlike cell-permeable MTT, and its insoluble formazan that accumulate inside cells).

Pink WST produced orange formazan (true experiment)

---References--

1. Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, and Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica 120: 159-167 (2018).
 2. Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005).

3. Mosmann, Tim, Rapid colirimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods, 65 (1-2): 55-63 (1983).

4. https://www.dojindo.com/store/p/456-Cell-Counting-Kit-8.html (2019/01/10)