RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)
RRBS kết hợp giữa RE (restriction Enzymes) và BS (Bisulfite
Sequencing) vùng genome có tần suất CpG cao (CpG islands). Thay vì giải mã trình tự toàn bộ gene (WGBS) rất tốn kém và
không cần thiết cho nghiên cứu về sự thay đổi methyl hóa DNA (DNA methylation).
RRBS được Meisser và cộng sự phát triển từ năm 2005 là bước đột phá mới trong
nghiên cứu DNA methylation.
Tổng quan về protocol
- Phân cắt DNA bởi RE (Enzyme digestion)
Đầu tiên DNA genome được cắt thành từng đoạn nhỏ (fragments)
bằng cách sử dụng một enzyme cắt giới hạn không nhạy cảm methyl hóa (a
methylation-insensitive restriction enzyme). RE này không ảnh hưởng đến trạng
thái methyl hóa của vùng CpGs (CpG sites – vùng mà Cytosine đứng cạnh Guanine).
RE này cho phép cắt cả vị trí methyl hóa (methylated) và vị trí không methyl
hóa (unmethylated).
Mspl (5’CCGG3’) là enzyme thông dụng được sử dụng trong kỹ
thuật này (hình …). Kết quả của việc cắt này là những đoạn DNA với các chiều
dài khác nhau.
- Sữa chữa đầu cuối và kết đuôi A
Do đặc điểm của MspI cắt sợi đôi DNA, sản phẩm này tạo ra những
đầu dính (sticky ends). Sữa chữa đầu cuối bằng cách thêm một nucleotide A vào đầu
3’ của chuỗi DNA. (phản ứng gồm dCTP, dGTP và ddATP)
- Sequence adapters: gắn với những đoạn DNA. Để giải trình tự sử dụng máy giải trình tự Illumina Sequencers, những sequence adapters này lai với adapter trên dòng (on the flow cell).
- Làm sạch những đoạn DNA (fragment purification): những đoạn DNA mong muốn được chọn lọc và làm sạch. Sàng lọc trên gel electrophoresis. Theo Gu và cộng sự thì những đoạn DNA có chiều dài 40-220 bq là tiêu biểu cho vùng promoter hay CpG islands.
- Bisulfite conversion: Những đoạn DNA này được thực hiện bisulfite conversion. Phản ứng này khử unmethylated Cytosine thành Uracil. Những methylated Cytosine được giữ nguyên vì nhóm methyl trên methylated cytosine được bảo vệ bởi phản ứng bisulfite conversion.
- PCR: Những đoạn DNA đã chuyển đổi bisulfite được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi bổ sung đoạn adapters sequence.
- Làm sạch sản phẩm PCR: loại bỏ reagents như dNTPs hay muối. Run gels hoặc sử dụng kit chuyên biệt cho làm sạch sản phẩm PCR.
- Sequencing: Những đoạn fragments sẽ được giải trình tự. Trước đây, người ta dùng Sanger sequencing để giải trình tự, bây giờ là NGS (next generation sequencing – Illumina sequencing), 36-base single-end sequencing reads được thực hiện phổ biến nhất.
- Sequencing alignment và analysis: do đặc điểm đặc biệt của RRBS, phải sử dụng những phần mềm đặc biệt để phân tích. Bởi việc sử dụng enzyme MspI để cắt (digest) những đoạn DNA fragment nên các đoạn luôn bắt đầu bằng C (nếu cytosine bị methyl hóa) hoặc T (nếu cytosine không bị methyl hóa và được chuyển thành uracil trong bisulfite conversion). Do đó, khi align một phần cặp sơ sở không ngẫu nhiên. Ngoài ra, còn một phần bị lệch do tần số sai lệch của C và T trong các mẫu. Những phần mềm để align và phân tích RRBS như Maq, BS Seeker, Bismark hoặc BSMAP.
---www.mitabio.com---
Tài liệu tham khảo:
1. https://www.illumina.com/
2. Alexander Meisser, Andreas Gnirke, George W.Bell, Bernard Ramsahoye Eric S. Lander, Rudolf Jaenisch, Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis, Nucleic Acids Research, Vol.33, Issue 18, January 2005, p.5868-5877
No comments:
Post a Comment